Allgemeine Hinweise zum Experimentieren und Disclaimer beachten!

Die Gramfärbung – entwickelt vom dänischen Bakteriologen Hans Christian Gram - ermöglicht es, Bakterien anhand von Unterschieden im Aufbau der Zellwände zu unterscheiden. Aufgrund der Einfachheit und kurzen Zeitdauer bis zu einem Ergebnis ist die Gramfärbung auch heute noch ein wichtiges Mittel in der Diagnostik bakterieller Infektionskrankheiten.

SCHWIERIGKEIT:

Schülerexperiment - schwer

GERÄTE

Mikroskop, Becherglas 250 ml, 5x 50 mL Becherglas, Pasteurpipetten, Objektträger, Bunsenbrenner, Feuerzeug

CHEMIKALIEN

0,1 % ethanolische Kristallviolett Lösung
0,1 % wässrige Safranin-T Lösung
5 % Lugol’sche Lösung
Aceton
Immersionsöl

HINWEIS

Kristallviolett und Safranin-T sind hervorragende Farbstoffe. Entstandene Flecken auf Kleidung oder Gegenständen lassen sich kaum mehr entfernen

DURCHFÜHRUNG

Zuerst werden die benötigten Lösungen hergestellt:

0,1 % ethanolische Kristallviolett Lösung: 0,08 g Kristallviolett werden in 100,0 mL 96 % Ethanol gelöst.
0,1 % wässrige Safranin-T Lösung: 0,1 g Safranin T werden in 99,9 mL dest. Wasser gelöst.
5 % Lugol’sche Lösung: 5 g Iod und 10 g Kaliumiodid werden in einem 250 mL Becherglas eingewogen und mit 85 mL verdünnt.

Vorbereiten der Probe

Eine bakterienhaltige Probe (z.B. ein Tropfen Wasser aus einem Heuaufguss) wird auf einem Objektträger ausgestrichen, sodass die eingenommene Fläche ungefähr 1x1 cm entspricht und an der Luft zum Trocknen belassen. Zur Fixierung wird der Objektträger 3x durch die nicht leuchtende Brennerflamme gezogen.

Gramfärbung

Der Objektträger mit der fixierten Probe wird nun auf ein 250 mL Becherglas gelegt und die Gramfärbung entsprechend dieser Reihenfolge durchgeführt. Nach jeder Lösung ist gut mit dest. Wasser zu spülen!

0,1 % Kristallviolett Lösung (60 sek.)
5 % Lugol’sche Lösung (60 sek.).
Aceton (2 sek.)
0,1 % Safranin-T Lösung (30 sek.)

Der Objektträger wird an der Unterseite und den Rändern mit Küchenrolle abgewischt und zum endgültigen Trocknen für wenige Minuten an der Luft aufgelegt.

Interpretation

Das Präparat wird bei mind. 1000x Vergrößerung ohne Deckglas (!) unter Ölimmersion mikroskopiert. Gram-positive Bakterien erscheinen dunkelviolett, während gram-negative Arten hell bzw. zartrosa dargestellt werden.

ENTSORGUNG

Die Färbelösungen und das Spülwasser werden im Becherglas, auf dem der Objektträger liegt, gesammelt und später als organisch-wässriger, halogenhaltiger Abfall entsorgt.

ERKLÄRUNG

Gram-Positive Bakterien besitzen eine sehr dicke Zellwand die aus Peptidoglycanen (Murein) besteht. Diese Mureinhülle wird durch das Kristallviolett angefärbt und reagiert mit Lugol’scher Lösung zu einem Kompex. Aceton kann diesen Farbstoff aus der Mureinhülle nicht mehr herauswaschen.

Anders als bei gram-postiven Bakterien, haben gram-negative nur eine sehr dünne Mureinhülle, die von einer Lipidschicht umgebeben ist. Aceton wirkt lipidlösend, wodurch das Kristallviolett ausgewaschen werden kann. Das Gegenfärben mit Safranin-T macht die ansonsten durchsichtigen Bakterien wieder sichtbar.

Das Gramverhalten ist nicht immer eindeutig. Es gibt Baktierien, die ihr Gramverhalten ändern (z.B. mit der Lebensdauer) oder auch gramunbestimmte Arten.